有研究提示，目前还不清楚的是掺入RNA对细胞毒性的作用，其对转运RNA受体活性、蛋白合成错误编码、抑制核糖体RNA（rRNA）的成熟，和加工都有作用。近期，注意力集中到抑制核RNA加工成小分子量类型的过程上。 5-FU其他的转录后效应，包括抑制信使RNA（mRNA）的聚腺苷酸化、和DNA引物酶的作用。，在某些肿瘤模型和肿瘤细胞系中，有充分的证据说明，这些RNA事件与细胞毒性相关，特别在监测长期暴露的效应时。
胸苷酸合成酶（TS）定义更清楚的作用位点是，FdUMP导致胸苷酸合成酶共价失活。对碳转移相关酶的直接抑制，确认了这一作用位点，后续的研究证实了反应过程的特定步骤，即5，10-亚甲基四氢叶酸的亚甲基基团，转移到2-脱氧尿苷酸的5位上。这些研究，完整地建立了稳定的三元复合物的构造，即5-氟脱氧核苷酸类似物、还原型叶酸衍生物和胸苷酸合成酶。
这种抑制的明显作用是：诱导酶的缺陷、消耗dTTP以及阻断后单磷酸脱氧尿苷酸（dUMP）的聚集。有研究显示，在某些肿瘤或正常组织中，不能与FdUMP形成三元复合物的限制因素，是还原型叶酸衍生物的可获得性。
由于这个因素是限制性的，增加亚叶酸钙就可能增强抑制作用。另外，一些研究分析了用静脉5-FU治疗结直肠癌、头颈部肿瘤和乳腺癌时，TS表达和治疗结果之间的关系，证据表明TS高水平的患者有效的机会较少。这些研究，缺乏相关性的一个可能的解释是，疗效包含TS以外的因素。
同时研究已经显示，肿瘤缓解和生存可能由多种因素决定，包括TS、DPD以及嘧啶合成代谢途径中多种酶，它们控制了5-FU合成代谢的相互转化。在DNA的核苷酸连接键中，检测出了少量的5-FU；比如说dUTP、FdUTP，当它们存在时是CTP对DNA多聚酶的作用，不仅仅依赖于多聚酶还依赖于序列。